槲皮万寿菊素体外抗氧化及色素保护作用研究
程帅1,2,3，王欢欢1,2,3，吴迪1,2，高伟2*，连运河2*
1.河北省植物天然色素产业技术研究院（曲周）；2.晨光生物科技集团有限公司（曲周）；3.河北省植物资源综合利用重点实验室（邯郸）
摘要主要研究槲皮万寿菊素的总抗氧化能力测定，对DPPH、ABTS、OH自由基的清除能力,及对辣椒红素、番茄红素的保护作用。采用紫外分光光度法比较槲皮万寿菊素、槲皮素、乙氧基喹啉、茶多酚、BHT等清除自由基及总抗氧化能力，结果表明槲皮万寿菊素具有较强的抗氧化剂清除自由基能力。采用色差法对比添加槲皮万寿菊素、茶多酚、乙氧基喹啉的辣椒红素和番茄红素，结果表明槲皮万寿菊素能大大减缓番茄红素和辣椒红素氧化褪色。槲皮万寿菊素做为抗氧化剂、护色剂具有广阔应用前景。
全国万寿菊种植面积达上百万亩，万寿菊主要用于提取叶*素，提取后的万寿菊渣则用于饲料或当废弃物处理。而万寿菊渣含有大量的槲皮万寿菊素，文献报道槲皮万寿菊素具有很好的抗氧化功效[1-5]。实现万寿菊资源充分利用，明确槲皮万寿菊素功效和应用具有很大的经济和社会意义。
试验主要槲皮万寿菊素总抗氧化能力、清除自由基、保护色素等功效，以期为槲皮万寿菊素作为抗氧化剂的应用提供理论基础。
1材料与方法
1.1材料与试剂
QG（80%槲皮万寿菊素）、辣椒红素、番茄红素、茶多酚（晨光生物科技集团股份有限公司）；BHT（Macklin）；DPPH、ABTS、TPTZ、（aladdin）；EQ(乙氧基喹啉)、六水氯化铁、K2S2O8（九鼎化学）；醋酸钠、冰醋酸、硫酸亚铁、无水乙醇、水杨酸、H2O2（分析纯）；食盐（市售）；。
1.2仪器与设备
电子天平（AUY，日本岛津）；紫外可见分光光度计（UV，上海天美科学仪器有限公司）；冰箱（BCD-SD，海尔）；水浴锅（HHS-21-4，上海博讯实业有限公司医疗设备厂）电热鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）。
1.3方法
1.3.1总抗氧化能力的测定—亚铁离子还原能力(FRAP)
10mmol/L的TPTZ溶液配置：称取TPTZ样品31.mg，用40mmol/L的盐酸定容至10ml，置于冰箱冷藏备用。
FRAP工作液配置（现配现用）：2.5ml10mmol/L的TPTZ溶液，2.5ml20mmol/L的六水氯化铁和25ml0.3mol/L的醋酸缓冲液（5.1g的醋酸钠加20ml的冰醋酸用水定容至ml，pH为3.6，避光备用）混合均匀即可得到FRAP工作液。样品液配置：用与水互溶的溶剂配置浓度分别为2.4、4.8、7.2、9.6、12ug/ml的样品溶液。对照组BHT（乙醇做溶剂）。
FeSO4标准曲线的绘制：配置浓度分别为、、、、umol/L的硫酸亚铁溶液，取该溶液0.5ml，加入4.5ml预热至37℃的FRAP工作液，摇匀后放置10min，于nm检测吸光度值。每个样品平行测定三次,根据所得吸光度的平均值制作标准曲线。
取样品液0.5ml，加4.5ml预热至37℃的FRAP工作液，摇匀后放置10min，于nm检测吸光度值，样品所需溶剂代替样品液加入FRAP工作液作为空白。根据所得吸光值A，在标准曲线上求得相应FeSO4浓度，定义为FRAP值，其值越大，抗氧化活性越强[6-7]。
1.3.2ABTS自由基清除能力的测定
样品溶液配制：
用对待测产品溶解度好并且与无水乙醇互溶的溶剂，配制活力浓度为1、2、3、4、5、6ug/ml的样品溶液。
储备液配置：
ABTS储备液和K2S2O8储备液均用纯净水配制。
ABTS储备液(7.4mmol/L)和K2S2O8储备液(2.6mmol/L)等体积混合暗室放置12-16小时。
取放置好的储备液，用无水乙醇稀释到吸光光度值在0.7左右（大约40-50倍），取2.4ml储备稀释液和0.6ml（丙酮或水）测定A，避光静置6min，于nm测定吸光度。2.4ml储备稀释液和0.6ml不同浓度样品测定A样，避光静置6min，于nm测定吸光度。无水乙醇进行矫零[7-11]。
清除率计算方法：
1.3.3DPPH自由基清除能力的测定
样品溶液配制：
用对待测产品溶解度好并且与无水乙醇互溶的溶剂，配制活力浓度为1、2、3、4、5、6ug/ml的样品溶液。
DPPH用无水乙醇配制成2×10-4mol/L的溶液，准确吸取不同浓度样品溶液、DPPH溶液各2mL，混匀，于30℃水浴下避光放置30min，于波长nm处测定吸光度A样，2ml无水乙醇和DPPH溶液2ml混匀后室温下放置10min，于波长nm处测定吸光度A，用无水乙醇矫零[7-11]。
清除率计算方法：
1.3.4羟自由基清除能力测定（水杨酸法）
样品溶液配制
配制活力浓度为，，，，ug/ml的样品溶液，样品配制所需溶剂为与水互溶的溶剂。
试剂溶液配制：9mmoI/L水杨酸-乙醇溶液，9mmol/LFeSO4溶液，8.8mmol/LH2O2溶液。
按下表中顺序分别加入不同样品，37℃水浴15min，nm测定吸光度[10-15]。
类别
A0
A样
A本底
水杨酸-乙醇溶液
1ml
1ml
1ml
FeSO4溶液
1ml
1ml
1ml
不同浓度稀释样品
1ml
1ml
水
12ml
11ml
12ml
H2O2溶液
1ml
1ml
37℃水浴15min，nm测定吸光度
计算方法：
1.3.5对辣椒红护色效果实验
精确称取辣椒红色素样品4份，分别按0.2%添加柠檬酸，再分别按有效含量0.1%添加槲皮万寿菊素、茶多酚、EQ和空白。搅拌均匀后，分别用食盐稀释倍，搅拌均匀后，于高温下（℃）放置，不同时间下观察色素保留情况。
1.3.6对番茄红素护色效果实验
精确称取番茄红素油树脂样品4份，分别按有效含量0.1%添加槲皮万寿菊素、茶多酚、EQ和空白。搅拌均匀后，分别用食盐稀释倍，搅拌均匀后，于高温下（℃）放置，不同时间下观察色素保留情况。
2结果与分析
2.1总抗氧化能力的测定—亚铁离子还原能力(FRAP)
以不同浓度FeSO4为标准溶液,根据反应后样品溶液在nm处的吸光度值A绘制标准曲线,如图(1)所示。以FeSO4浓度x(mmol/L)与其反应后相应吸光度值y(A)进行线性回归，所得方程为：y=1.x+0.，相关系数R2=0.，表明FeSO4浓度在0~0.5mmol/L范围内与A具有良好的线性关系。采用相同的实验方法，依照标准曲线求得不同浓度BHT、槲皮万寿菊素、EQ、茶多酚、槲皮素的总抗氧化能力，如图(2)所示。从图中可以看出，BHT、槲皮万寿菊素、EQ、茶多酚、槲皮素的总抗氧化能力具有浓度依赖性：总体来说,随着浓度增大，其总抗氧化能力进一步增强；其抗氧化能力对比为：槲皮万寿菊素＞槲皮素＞茶多酚＞BHT＞EQ。
图1亚铁离子还原能力标准曲线
（槲皮万寿菊素对茶多酚、槲皮素、EQ非显著，对BHT是极显著**）
图2样品随浓度增大总抗氧化能力变化情况
2.2ABTS自由基清除能力的测定
ABTS?自由基较稳定，甲醇或乙醇溶液呈深紫红色，最大吸收峰。ABTS?之所以稳定，是氮上成单自由基与苯环形成p-π共轭。ABTS+·自由基为RNS自由基。由于ABTS?+自由基是一种带正电荷的自由基，因此它可以从抗氧化剂分子中获得一个电子形成稳定的中性分子，故ABTS?+自由基被清除主要涉及到电子转移(ET)机制。通过在体系中加入不同浓度抗氧化剂，根据吸光值计算ABTS+清除率，并计算IC50值来比较不同抗氧化剂对ABTS+清除能力。通过图3可知，不同浓度的茶多酚、槲皮万寿菊素、槲皮素、EQ、BHT对ABTS自由基清除具有浓度依赖性，随着浓度增大,其ABTS自由基清除能力进一步增强;其中ABTS自由基清除能力对比为茶多酚＞槲皮万寿菊素＞槲皮素＞EQ＞BHT。80%槲皮万寿菊素在6ug/mL时，对ABTS＋?清除能力达到69%。
（槲皮万寿菊素对茶多酚、槲皮素、TBHQ非显著，对EQ显著*，对BHT、VE是极显著**）
图3不同抗氧化剂随浓缩上升对ABTS+的清除能力
样品名称
回归方程
R2
IC50（μg/ml）
茶多酚
y=13.x+3.58
0.
3.4
槲皮素
y=7.x+19.
0.7
3.97
槲皮万寿菊素
y=11.x+3.
0.
4.07
EQ
y=5.x-0.
0.
9.24
BHT
y=3.42x+0.08
0.
14.6
图4不同抗氧化剂清除ABTS+的IC50值
2.3DPPH清除能力的测定
DPPH自由基DPPH是一种很稳定的氮中心的自由基，DPPH自由基的清除过程主要涉及到氢转移（HAT）。在无水乙醇溶液中呈紫色，在nm波长处有最大吸收，吸光度与浓度呈线性关系。向其中加入自由基清除剂时，可以结合或替代DPPH自由基，使自由基数量减少，吸光度变下，溶液颜色变浅，借此可评价清除自由基的能力。图5可知：不同浓度的茶多酚、槲皮万寿菊素、槲皮素、EQ、BHT对DPPH自由基清除具有浓度依赖性，随着浓度增大，其DPPH自由基清除能力进一步增强；其DPPH自由基清除能力为茶多酚＞槲皮万寿菊素＞槲皮素＞EQ＞BHT。80%槲皮万寿菊素在6ug/mL时，对DPPH清除能力达到52%。
（槲皮万寿菊素对茶多酚、槲皮素、TBHQ、EQ、BHT非显著，对VE显著*）
图5不同抗氧化剂随浓度上升对DPPH的清除能力
样品名称
回归方程
R2
IC50（μg/ml）
茶多酚
y=9.x+3.
0.
4.72
80%槲皮万寿菊素
y=10.x-5.
0.
5.38
槲皮素
y=7.x-4.
0.
7.52
EQ
y=3.06x+3.
0.
15.11
BHT
y=3.x+2.02
0.
15.78
图6不同抗氧化剂清除DPPH的IC50值
2.4OH自由基清除能力的测定
利用Fenton反应产生羟?自由基:H2O2+Fe2+=OH+H2O+Fe3+在反应体系?中加入水杨酸,Fenton反应生成的羟自由基与水杨酸反应，生成于nm处有特殊吸收的2，3-二羟基苯甲酸。如果向反应体系中加入具有清除羟自由基的物质，就会减少生成的羟自由基，从而使有色化合物的生成量减少。数据显示：不同浓度槲皮万寿菊素、槲皮素、茶多酚和EQ对羟自由基的清除具有浓度依赖性，随着浓度增大，其羟自由基清除能力进一步增强；BHT不具备浓度依赖性。各物质对羟自由基的清除能力依次为槲皮万寿菊素＞茶多酚＞EQ＞槲皮素＞BHT。80%槲皮万寿菊素在ug/mL时，对OH清除能力达到86%。
（槲皮万寿菊素对茶多酚、槲皮素、EQ显著*，对BHT是极显著**）
图7不同抗氧化剂随浓度上升对OH的清除能力
样品名称
回归方程
R2
IC50（μg/ml）
茶多酚
y=0.x+0.
0.
槲皮素
y=0.x+0.
0.
槲皮万寿菊素
y=0.x+0.
0.
EQ
y=0.x+0.
0.
图8不同抗氧化剂清除OH的IC50值
3、结论
通过对比槲皮万寿菊素、槲皮素、乙氧基喹啉、茶多酚、BHT等清除自由基及总抗氧化能力，结果表明槲皮万寿菊素具有较强的抗氧化性，清除自由基能力较强。槲皮万寿菊素做为抗氧化剂、具有广阔应用前景。
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